关于微生物质谱,我有3个问题

1、微生物质谱到底是个啥?

提到“微生物质谱”,不妨把这一词组拆开来看,“微生物”大家都懂,就不多说了,那么“质谱”到底是啥?

质谱分析是一种通过测量离子质荷比(质量-电荷比),从而确定其质量的分析方法(通俗点讲,质谱就是一种类型的“秤”,只不过它称量的是离子的质量),在众多的分析测试方法中被认为是一种同时具备高特异性和高灵敏度且得到了广泛应用的普适性方法(www.hapai.com.cn)。

质谱仪器一般由进样系统、离子源、质量分析器、检测器、数据处理系统等部分组成。由于进样方式、离子源、质量分析器等的不同,质谱仪分为不同的种类,临床上常见的有液相色谱串联质谱(LC-MS-MS)、气相色谱串联质谱(GC-MS-MS)、电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)等等。

我们通常所提到的微生物质谱法采用的就是基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)技术对微生物进行鉴定的方法。

MALDI-TOF MS的离子化方式是基质辅助激光解吸电离(MALDI),是一种“软电离”的方式,这种电离方式可以产生稳定的分子离子,因而是检测生物大分子的有效方法,广泛地运用于生物化学,尤其对蛋白质、核酸的分析研究已经取得了突破性进展。

图. MALDI-TOF MS的仪器结构

那么,MALDI-TOF MS是如何进行样本检测的呢?首先,用一定强度的激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜,基质从激光中吸收能量,与样品之间发生电荷转移使得样品分子电离。离子在高压电场作用下加速进入飞行管中,小离子飞得快,先到达探测器,大离子飞得慢,后到达探测器,从而得出测定结果。

图. MALDI-TOF MS的工作原理

2、质谱为什么能够鉴定微生物?

以细菌为例,细菌是原核生物的一类,是一类形状细短,结构简单,多以二分裂方式进行繁殖的原核生物,是在自然界分布最广、个体数量最多的有机体,是大自然物质循环的主要参与者。细菌主要由细胞膜、细胞质、核质体等部分构成,有的细菌还有荚膜、鞭毛、菌毛等特殊结构。

图. 细菌结构

MALDI-TOF MS之所以能够对细菌进行鉴定,是因为细菌的核糖体蛋白具有保守性,一般不会随生长条件的变化而变化,而不同细菌的核糖体蛋白指纹图谱具有各异性,指纹图谱中的某些峰具有属、种,甚至亚种特异性。另外,同种细菌在同一培养条件下生长,所得到的质谱结果具有可重复性,这使得MALDI-TOF MS鉴定细菌结果更加准确。

肠杆菌的质谱图

结核分枝杆菌的质谱图

图. 不同菌种的蛋白指纹图谱

MALDI-TOF MS鉴定细菌基本流程是,将细菌纯培养后,点靶加释放液,细菌经过释放液充分处理后,可使得细胞内的蛋白成分更好地释放出来,待溶剂挥发后加基质,蛋白分子与基质形成基质结晶,上质谱检测。在质谱仪中,样品通过有效的电离将不同质荷比(m/z)的离子分开形成细菌特异性的清晰的指纹图谱,通过分析关键的质谱峰数据,与数据库中的已知菌种谱图进行比对,即可快速得到细菌鉴定结果。

图. 微生物质谱鉴定操作流程

3、为什么要用质谱做微生物鉴定?

那么,为什么要用质谱做微生物鉴定,而不是别的方法?这就要先来说一说目前的微生物鉴定方法。

目前微生物鉴定常用的方法为生化原理检测,即先判断革兰氏阴性还是阳性,再根据形态、酶反应、显色等不同方法,将具体微生物种类鉴定出来。

对于绝大多数的微生物检测有一个绕不开的环节,那就是标本处理和培养。需要首先对样本进行预处理,根据涂片染色的结果选择合适的培养基分离培养,然后根据菌落特点,选择适当的生化反应或者自动仪器鉴定。

然而,生化法微生物检测样品培养时间长,短到几小时,长到几天都有可能;只能鉴定常规菌种,准确度一般;另外,就是鉴定流程较复杂,离不开人工干预,耗时长(十几个小时甚至更长时间)。

由于鉴定原理的不同,微生物质谱法可大大简化微生物的鉴定流程,缩短鉴定时间,上机之后,基本10min之内就可以鉴定出96个样本,称得上是一种微生物快速鉴定方法。

理论上,微生物质谱的数据库可以无限大(当然这也只是在理论上)。目前市面上的微生物质谱产品数据库少则含有2000余种微生物,多的也有超4500余种的(例如融智生物的QuanID微生物质谱系统),远远大于生化法的数据库种类。而且,数据库可扩展,用户可根据需要自建库。

另外,而且是最重要的一点,就是微生物质谱鉴定的准确性高。除了得益于超大的数据库外,质谱硬件的性能也是鉴定准确性的保证。QuanID微生物质谱系统依托于新一代宽谱定量飞行时间质谱平台QuanTOF(新一代的MALDI-TOF MS),检测质量范围更宽(10-1000,000Da),重现性更高(SD<5%),保证了微生物鉴定结果的高准确性

此外,QuanID微生物质谱系统的数据库还有一个独特之处,就是分为一级、二级两个数据库,二级菌库涵盖100多种相似病原体,可对基因型相近的难分辨微生物(如:大肠杆菌和志贺氏菌等)做出准确鉴定。

怎么样,这3个问题有没有让你对微生物质谱有了全面的了解呢?

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